药物设计│生物素在药物设计中的经验教训

1. 前言

生物素（维生素B7）是所有三个领域生命中必不可少的辅酶，生物素酶家族利用它来固定、转移和去除CO2。生物素是live2d地球上生命开始后唯一可能出现的B 族维生素，因为它不含核苷酸，因此不能结合RNA，这是生命前RNA世界的一个重要特征。也许正是这种进化中的独特位置导致生物素产生已知的最强的非共价分子-蛋白质相互作用，除了可能涉及金属辅因子的相互作用。生物素分别与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的飞摩尔和皮摩尔结合可能已有数十亿年的历史，但它对今天的药物设计仍然具有重要意义。

链霉亲和素和亲和素（Avidin）是同源四聚体蛋白（图1A），每个亚基由八个反平行的β链组成，形成一个β-barrel，其末端与生物素结合（图1B）。分别由链霉亲和素和亲和素的8和12个氨基酸组成的灵活环关闭了生物素顶部的超白玻璃结合口袋，并显著促进了结合。由于两个稳定柔性环的突变，工程化的陷阱亲和素显示出与生物素更强的结合。生物素由两个稠合的五元、脲基和四氢噻吩环组成，带有一个侧链戊酸（图2，化合物1）。 1927年，生物化学家 M. A. Boas 发现生吃蛋清会导致大鼠“蛋清损伤”，主要是严重的皮疹，可以通过肝脏中的物质治愈。1940年，Vincent du Vigneaud 确定了治疗物质是生物素和“蛋清损伤”，即因过量食用生鸡蛋中的抗生物素蛋白而导致的生物素缺乏症。生物素与亲和素结合，具有惊人的结合自由能-20.75 kcal/mol，并在此过程中发挥其酶活性。相关且更广泛研究的细菌蛋白质链霉亲和素表现出已知的第二强结合自由能-18.3 kcal/mol。考虑到生物素在生理pH值下由31个原子（包括氢）组成，其分子量仅为240 Da，这就显得更加不寻常了。有趣的是，生物素是一种焓结合剂，如 HIV蛋白酶抑制剂达芦那韦和HMG-CoA 还原酶抑制剂瑞舒伐他汀。生物素的大焓结合贡献伴随着熵损失，由于链霉亲和素的盖子更灵活，链霉亲和素（图1C）比亲和素（图1D）更大。将从这个角度讨论生物素如何实现其高焓结合亲和力以及由此产生的药物设计经验教训。

图1. 生物素、链霉亲和素和结合的结构信息。 (A) 链霉亲和素四聚体结构（PDB ：1SWA）。 (B) 链霉亲和素单体显示β-barrel结构，生物素结合到一端，柔性环（残基45-52）呈黄色（PDB：3RY2，链A）。(C)生物素与链霉亲和素结合的热力学特征。(D) 生物素与亲和素结合的热力学特征（图片来源：J. Med. Chem.）。图2. 生物素tcp连接和水与链霉亲和素结合。(A)生物素和链霉亲和素（PDB：3RY2）之间形成的六个 CH-π（四个中央和两个外围）和两个 CH-O 氢键。红点代表正常投影到相应色氨酸环的芳香平面上。 (B) 生物素和链霉亲和素（PDB：3RY2，链 A）之间形成的10个极性相互作用（经典 H 键和电荷相互作用）。(C) 计算出存在于链霉亲和素生物素结合口袋的极性区域的五聚体冰状水结构。(D) 覆有生物素的冰状水结构。(E)在链霉亲和素隆胸需要多少钱 (PDB： 7EK8) 的环境温度 apo 结构中观察到的七种生物素结合口袋水。(F) 覆盖有生物素的七种生物素结合口袋水。 PDB：3RYU用于生物素结合描述（图片来源：J. Med. Chem.）。2. 氢：最重要但最被忽视的原子

今天的药物设计从业者经常偏向于非氢原子，忘记了氢在爱豆网分子识别中的核心作用。配体效率 (LE) 指标通常被归一化为非氢原子数，并且在2D和3D结构表示中，药物化学家很少描述与杂原子相连的氢原子之外的氢原子。氢键包含一对由氢原子桥接的负电原子，可分为四类：(1) XH-n 或经典H键，其中X是供体杂原子，n是一个孤对电子受体杂原子；(2) XH−π氢键，其中π是任何π电子受体系统；(3) CH-n 氢键，其中CH是供体基团；(4) CH-π 氢键。

在去质子化状态的生物素的31个原子中，16个是非氢原子，15个是氢原子，生物素的氢原子是其令人印象深刻的结合亲和力的主要原因。事实上，在生物素和链霉亲和素的 X射线晶体结构中明显的18个相互作用中（图2A、B），10个是由生物素的氢原子形成的，其中只有两个是经典的H键，其中六个是 CH-生物素的脂肪族C-H 键中诱导偶极子之间的π氢键和另外两个是CH-O氢键（图2A，B）。经计算，生物素结合的范德华贡献占总自由能的70%至95%，只有一小部相对标准偏差分来自静电和经典H键能。直接参与结合的生物素的其余4个非氢原子共形成8个相互作用，其中7个是永久偶极-偶极H键（5个与链霉亲和素结合，2 个与水分子结合）和一个生物素羧基氧和蛋白质之间的电荷-偶极相互作用。(图 2B)。

3. 配体和蛋白质未结合状态的水溶剂化

水分子在药物设计中至关重要，因为与蛋白质-药物复合物形成相关的所有三种状态（脱辅基蛋白、未结合的配体和蛋白质-配体）都与水分子发生溶剂化，并且这种溶剂化作用在焓和熵上都有助于结合自由能。

当与蛋白质结合时，与本体溶剂结合的水与载脂蛋白结合时会受到熵的限制。从蛋白质袋置换水分子并补偿置换水的焓结合能的配体可导致结合能的熵增益高达每个水分子2 kcal/mol，这通常被称为疏水效应。利用疏水作用产生熵药物，例如Tipranavir和 Fluvastatin。由于生物素是一种具有不利熵项的焓结合剂，疏水作用不是生物素极端亲和力的驱动因素。然而，检查生物素的溶剂化及其在亲和素上的结合口袋仍然是值得的。

计算出在生物素结合口袋的极性区域中存在一个由五种不同寻常的高排序水组成的冰状环（图2C）。五个结合的冰状水（ice-like waters）的总熵损失估计为 -12.75 kcal/mol，口袋的疏水区域中的三个额外水需要 -2.75 kcal/mol熵。DeChancie估计需要为配体补偿 -6.75 kcal/mol 的焓结合能以利用潜在的熵增益。最近，使用连续飞秒 X 射线晶体学，在生物素结合口袋中具有七水的链霉亲和素的完全溶剂化的环境温度apo结构被解析出来，其分辨率为1.7 Å（图 2E）。所有五个计算出的冰状水都将被生物素的两个五元环取代（图2D），而在晶体学上观察到的三个水将仅由脲基环显示（图2F）。剩余的四个结晶水位于结合袋的疏水部分，结合时与生物素的戊酸侧链重叠（图2F）。

未结合生物素的水溶剂化同样重要。有证据表明，生物素在溶液中采用折叠结构，其中羧酸根与脲基N1-H供体形成H键。然而，分子动力学研究表明，这种折叠构象只是很小的，因此对结合的整体自由能没有显着贡献。值得注意的是，这些少见的折叠构象的溶剂化程度低于扩展构象，并且可能在一定程度上对生物素的细胞渗透性很重要，就和观察到的针对嵌合体的蛋白水解的渗透性一样。

4. 经典H键和氧阴离子孔

经典H键的静电形成了与蛋白质以及与处于未结合状态的水形成非常稳定的非共价键的基础，因为需补偿去溶剂化损失，因此常会降低它们对复合物结合自由能的总体贡献。链霉亲和素结合口袋包含类似于蛋白酶的氧阴离子孔(图3A)。生物素的脲基的羰基部分与链霉亲和素的氧阴离子孔形成一个不寻常的三方氢键（图3B），类似于奥莱尔在乙酰胆碱酯酶中观察到的。由生物素的脲基形成的五个经典H键贡献了约30%的结合自由能。

图3. 生物素和高中政治链霉亲和素之间的极性相271互作用。 (A) 氧阴离子孔描绘为根据静电电位着色的表面：蓝色，带正电和红色，带负电。 (B) 与生物素脲基羰基的三重氧阴离子H键和来自脲基NH的两个经典H键。 (C) 生物素与链霉亲和素结合，突出显示了与口袋外围的羧酸盐结合的两种水。一种水在高分辨率结构中采用两个不同的位置（PDB：3RY2 链 A），但这里只描绘了一个位置。 (D) 来自生物素四氢噻吩环和Thr90的硫原子的以硫为中心的H键（图片来源：J. Med. Chem.）。

氧阴离子孔（Oxyanion hole）是由H键供体偶极子的不利排列形成的，在链霉亲和素的情况下是三个。氧阴离子空穴钨钢与水相比会引起更大的H键极化，从而减少去溶剂化损失。生物素与链霉亲和素结合时的偶极子为15.72 D，而用水溶剂化时仅为9.27 D。此外，与溶剂化相反，由于这种预先排列发生在蛋白质折叠过程中，因此不会因不利地安排H键供体而支付熵损失。虽然计算的脲基与四个水分子结合的总结合能仍然相当大 (-14.2 kcal/mol)，但它明显低于与做网站链霉亲和素的结合能 (-35.2 kcal/mol)。咪唑酮和亲和素之间的结合自由能证实了这一点，预计将取代结合口袋极性区域中所有 X 射线观察到的水，为 -4.5 kcal/mol，代表约 20%整体绑定（图4）。虽然咪唑酮脲官能团取代了形成理想H键的稳定水，但它在未结合状态下也高度溶剂化，因此遭受显著的去溶剂化惩罚，限制了其对结合亲和力的贡献。生物素-链霉亲和素结合是一个教科书示例，向药物设计人员展示了如何使用氧阴离子孔来克服经典氢键的去溶剂化惩罚。

图4. 生物素和一些抗生物素蛋白类似物的构效关系。生物素和许多类似物的结合自由能（y 轴）以图形方式表示。d-生物素 (1) ΔG = -20.75 kcal/mol，pH 7.4，(公务员加工资4)d-脱硫生物素 (2) ΔG = -16.9 kcal/mol，pH 7.0，d-脱硫生物素甲酯 (3) ΔG = -15.6 kcal /mol，pH 7.0，d-脱硫生物素醇 (4) ΔG = -14文曲星电子词典.1 kcal/mol，pH 7.0，dl-4-甲基咪唑酮 (5) ΔG = -6.1 kcal/mol，pH 7.0，咪唑酮 (6) ΔG = -在 pH 6.8 时为 4.5 kcal/mol（图片来源：J. Med. Chem.）。

已经在蛋白质数据库中大约3%的蛋白质中发现了潜在的氧阴离子空穴，这些蛋白质的催化功能已经预测，例如转移酶、水解酶和裂解酶。但由于氢原子的位置不正确，这个数字很可能被低估了。蛋白质晶体学通常不定位氢原子，氢的位置是根据预期的几何形状计算的。这适用于主链酰胺氢和一些侧链，如色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，但丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸（存在于链霉亲和素氧阴离子孔中的那些）侧链的氢定位需要进一步计物流专业就业前景算或直接测量以明确确定其位置。因此，如果在 3D 蛋白质-配体复合物中正确确定了所有氢的位置，那么药物化学家可能会使用许多未被注意到的氧阴离子空穴。

5. CH−π氢键和色氨酸

CH−π氢键很弱（每次相互作用的相互作用能为 -1.5 和-2.5 kcal/mol），但对药物设计者有许多优势，这使得它们可以说是最重要的相互作用，但令人惊讶的是，它们却是最不受欢迎的相互作用之一。首先，脂肪族CH键是可诱导偶极子而不是永久偶极子，因此当从处于未结合状态的水的高介电环境到绑定状态的蛋白质的低介电环境时，CH−π与经典H键相比，所付出的去溶剂化代价更小。其次，芳香系统为CH供体提供了大面积的电子密度作为目标，需要在结合口袋中的放置精度较低。第三，芳香环的大H键受体区域允许放置多个CH供体。最强的CH−π 氢键指向稍微偏离芳环（中央）的中心，与最大负静电势一致。芳香环外部存在较弱但仍然显着的负静电势，允许在单个芳香环系统上形成额外的外围 CH-π H 键（图5A）。CH-π 相互作用也被描述为不太强烈地依赖于距离，但这可能是测量到质心的距离的结果（图5A中的r和r'）。氢原子在芳环平面上的投影（图5ffmpegA中的距离R和R'）是一种更好的描述方式，因为这代表了供体和受体之间的最近距离。该投影与质心的距离（也是与最大负静电势的距离的近似值）描述了相互作用是强中心相互作用还是较弱外围相互作用（图5A中的距离 d 和 d'）。

图5. 生物素CH-π 和CH-O与链霉亲和素的相互作用。(A)中心CH−π相互作用（红色）和外围CH−π相互作用（蓝色）的几何参数。R是质子到平面的距离，r是质子到环中心的距离，θ是中心环垂线与质子到环中心矢量之间的夹角，d是法向投影的位移氢从芳香环的质心到芳香平面。（B）生物素和Trp79之间形成了三个CH-π相互作用（两个中心，一个外围）。(C)生物素和Trp108之间形成的两个中心CH-π相互作用。 (D)生物素和Trp120之间形成的外围 CH飞马无人机-π 相互作用。 (E)生物素与链霉亲和素柔性环的Asn49和Val47之间的两个CH-O 氢键。距离是测量从氢原子到芳香环（黄色）上的法线投影的距离，并且从质心d的法线位移在括号中给出。3 Å用作包含R和R'的截止值，d ≤ 1 Å 用作中心 CH−π 氢键的截止值，而 1 < d' ≤ 2 Å 用作外围 CH− 的截止值π 氢键。

对生物素类似物的构效关系及其与亲和素结合的自由能的进一步研究清楚地表明，戊酸侧链是生物素极端结合亲和力的主要来源（图4）。将柔性己酸侧链添加到 dl-4-甲基-咪唑酮 (5) 导致 d-脱硫生物素(2) 和结合能的巨大-10.8 kcal/mol提高。己酸基团将取代位于口袋疏水区域的四个水（图2F），导致对结合的显着熵贡献。然而，这不能解释结合能变化的幅度，因为脱硫生物素也是一种焓结合剂，与链霉亲和素的结合熵更不利。

生物素与链霉亲和素口袋疏水区域中三个色氨酸残基的芳环形成六个 CH−π H 键（四个中心和两个外围）：三个与Trp79的相互作用，两个与Trp108 的相互作用和一个与Trp120的H键（图5B-D）并且是生物素强焓结合的主要驱动因素。生物素的戊酸侧链亚甲基反映Trp7的吲哚环结构，形成了三个 CH-π 氢键，每个芳香环有两个中心氢键，以及一个外围氢键（图5B）。预计 CH α 对生物素羧酸盐的极化增加会导致特别强的 CH-π 相互作用。四氢噻吩环的亚甲基也与Trp108形成两个中心H键（图5C）。有趣的是，CH-π 相互作用也在链霉亲和素四聚体的亚基结合中发挥重要作用（在这种情况下，来自相邻亚基的Val47和Lys121侧链的脂肪族CH基团与Trp120）。还值得注意的是，碳水化合物通常采用与生物素相同的结合策略，与结合口袋中的芳香族残基，特别是色氨酸形成CH-π相互作用。

5. CH-O氢键和柔性回路

除了常规的H键和非常规的CH-π H键之外，CH-O的H键已被证明广泛存在于蛋白质、RNA和DNA中。至于CH-π氢键，CH-O氢键也可以与sp、sp2 和 sp3 杂化的CH供体形成，通常长度为2.3-3 Å，并且具有很强的线性趋势（CH-O角）。这种CH-O 氢键已广泛用于设计激酶抑制剂的铰链结合基序以及其他蛋白质-药物复合物。生物素与柔性环的Asn49和Val47的骨架酰胺羰基氧形成两个这样的sp3杂化CH-O相互作用（图 5E）。正如预期的那样，生物素羧酸酯基团的更多极化CH α 导致与Asn49 的最短H键（2.6 Å），与Val47的非极化 CH H 键在2.9 Å的较长距离处。正是这些烷烃CH-O氢键，其中CH键缩短（CH 红外伸缩频率蓝移），而对于炔烃 CH-O 键，CH 键延长（红移），就像经典氢键。

6. 羧酸盐：自带水分子

通过水和蛋白质之间的CH键的差异极化来补偿去溶剂化损失是生物素明显应用的一种策略，但生物素还应用了第二种策略，以最大限度地减少结合时的去溶剂化损失。正如预期的那样，生物素的羧酸盐已被计算为与水相中的水分子高度溶剂化。根据构象，4-7 个水分子与两个羧酸盐氧配位。生物素已将其羧酸盐基团置于链霉亲和素口袋的外围，以便它可以保持与两个水分子的结合，同时与链霉亲和素形成两个 H 键，从而减少补偿的去溶剂化损失（图3C）。将带电荷的官能团定位在药物分子上，使其暴露于大量水是一种有效的策略，不仅可以减少去溶剂化损失，还可以增加溶解度。

7. 硫作为氢键受体

尽管对蛋白质折叠很重要，硫在H键中的作用仍然是一个关于含硫H键的强度、性质和方向性的研究和争论的领域。硫具有与碳相当的电负性（鲍林标度 (χ) 分别为 2.58 和 2.55），但比氧小得多（χ = 3.44）。硫的适度电负性可能导致含硫氢键通常较弱的假设。然而，较大硫原子 (α = 19.4) 的极化率（在 H 键合中通常被忽略）远大于氧 (α = 5.3) 或氮 (α = 7.4)。

荧光浸渍红外(FDIR)光谱和观察到的NH-X相互作用的红移程度已被用于研究硫西方文学的H键受体强度。 FDIR光谱表明，二甲硫醚 (DMS) 的硫原子作为 H 键受体与二甲醚 (DME) 的氧原子相当。对于药物设计而言，重要的是，吲哚和水之间的 H 键观察到的红移仅为 DMS 和 DME中观察到的一半。因此，含氧醚和含硫醚似乎都是同样好的H键受体。

生物素四氢噻吩环中硫原子的作用同样神秘，与其酶促辅因子功能有关。 X射线晶体学清楚地显示了一个以硫为中心的H键与Thr90的OH供体（图 3D），但即使是Miyamoto和Kollman在他们的综合研究中也没有对除了列出它之外的相互作用做出评论。也有酱油瓶人提出生物素的硫原子通过脲基的π电子系统的离域形成 S-N 相互作用，从而增加了脲基氮原子的碱性和亲核性。硫在药物设计中的应用仍然不常见；尽管此类药物取得了成功，但即使采用针对半胱氨酸反应性 SH基团的共价番禺广场抑制剂也进展缓慢。

8. 小结

剖析生物素-链霉亲和素分子相互作用阐明了实现高结合亲和力的自然方法。有趣的是，生物素结合链霉亲和素的主要方法不属于当今药物设计中的主流方法，尽管它是已知的最强相互作用。生物素对现代药物设计者的主要信息是采用更加以氢为中心快乐戒烟法的方法。

分子被绘制时通常只描绘了杂原子结合的氢，暗示只有经典的H键是重要的。这可能导致人们对生物素最重要的相互作用类型缺乏认识：非经典的 CH-π 氢键。生物素不仅与每个芳族侧链形成一个 CH-π H 键，而且利用多个脂族 CH 相互作用（中央和外围）与色氨酸残基的 π 系统，导致令人惊讶的效力增益。随着改变游戏规则的被称为“Pi by NMR”的NMR方法的发展，CH−π 氢键在未来药物设计中的更核心用途最近变得更加引人注目，它可以阐明单个蛋白质配体的强度CH−π 相互作用。生物素还利用非经典的 CH-O 相互作用与链霉亲和素柔性盖的骨架羰基氧相互作用。

自然充分考虑了经典H键的使用和水生物素-链霉亲和素协同进化的作用。蛋白质表面上最适合经典H键形成的热点，例如氧阴离子孔，经常被忽视，因为在3D蛋白质结构测定中无法准确确定某些氨基酸侧链中与杂原子相连的氢的位置。生物素正是利用这样一个热点来最大限度地减少由脲基羰基形成的经典 H 键所带来的去溶剂化损失。生物素第二次使用结合和未结合状态的差分极化，其以硫为中心的经典氢键与Thr90结合。最后，生物素还通过将其羧酸盐的部分溶剂化保持在结合状态，从而降低了结合焓的去溶剂化损失。

生物素是一种古老的分子，可能与地球上的生命共同进化，产生了已知最强的蛋白质-配体复合物之一。生物素突出了药物设计中许多未充分研究和未充分利用的分子相互作用。采用生物素的结合策略有可能会有助于设计出更好的药物。

参考文献：

doi/10.1021/acs.jmedchem.1c00975